Автоматическая поправка на гематокрит для DBS анализа
Содержание
Для решения проблем, связанных влиянием гематокрита на параметры «сухих пятен крови», компания CAMAG разработала полностью автоматизированный модуль определения гематокрита, который позволяет быстро и просто измерять его величину и вводить поправки в DBS анализ. Принцип работы, основанный на спектроскопии в режиме отражения, был тщательно аттестован.
Встроенный в автосамплер CAMAG DBS-MS 500, сканнер позволяет проводить анализ «сухих пятен крови» на определенной длине волны для получения данных, которые коррелируют с величиной гематокрита.
Новый сканнер устраняет необходимость объемного отбора проб для количественного DBS анализа: когда используется фиксированная область экстракции внутри пятна крови с элюированием из центра каждого пятна и коррекцией содержания целевого аналита относительно величины гематокрита.
Коррекция на величину гематокрита компенсирует изменение объема крови в пределах фиксированной площади пятна, так как распределение крови на фильтровальной бумаге зависит от гематокрита. Следовательно, знание точного объема крови при нанесении не является более необходимым.
Область применения
Сканер гематокрита позволяет компенсировать любое известное влияние гематокрита, такие как изменение площади пятна, изменение степени извлечения или свойств аналита, связанных с гематокритом. Кроме того, можно нормализовать аналитический результат к полученной величине гематокрита. Система идеально подходит для надежного количественного анализа DBS проб с неизвестным объемом крови (т.е. при нанесении без измерений объема).
Рекомендуемое оборудование
- Автосамплер CAMAG DBS-MS 500 со встроенным сканнером гематокрита.
- ВЭЖХ-МС/МС система для работы с DBS автосамплером (например, Shimadzu 8050 или аналог).
- Центрифуга или анализатор крови для приготовления калибраторов гематокрита
Дополнительно:
- Робот CTC PAL для отбора проб в виалы.
Пробы
Подлинные образцы могут быть скомпонованы с выбранной калибровочной серией. Таким образом, пользователь может свободно построить свою собственную калибровочную кривую для своих DBS карточек (фильтровальной бумаги), типа антикоагулянта и калибровочного диапазона. Было подтверждено, что измерение гематокрита, основанное на коэффициенте отражения, не зависит от условий хранения, срока хранения и температуры.
Подготовка калибраторов гематокрита
Образцы калибраторов для гематокрита могут быть получены с использованием двух различных способов:
Способ 1
Свежесобранную кровь центрифугируют при температуре окружающей среды в течение 10 мин при 1600 RCF для разделения эритроцитов (RBC) и плазмы. Эти две фракции собирают в отдельные пробирки и затем смешивают в разных пропорциях в пробирки Eppendorf с помощью автодозатора для получения калибраторов с различными величинами гематокрита (например, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, и 0,7). Затем из каждой пробирки калибраторы наносят карточки Ahlstrom TFN и высушивают в течение не менее 3 ч при комнатной температуре.
Способ 2
В способе 2 используется либо добавление, либо удаление плазмы. Свежесобранную кровь с известной величиной гематокрита сначала центрифугируют в отдельных пробирках при 1300 RCF в течение 10 минут, чтобы в конечном итоге получить разный гематокрит (например, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, и 0,7). После центрифугирования плазма либо удаляется, либо добавляется в каждую пробирку для достижения желаемой величины гематокрита и проба снова тщательно перемешивается. Затем из каждой пробирки калибраторы наносят карточки Ahlstrom TFN и высушивают в течение не менее 3 ч при комнатной температуре.
Для точного сравнения величин гематокрита подготовленные калибровочные образцы жидкой крови каждого калибратора должны быть проанализированы либо с помощью гематологического анализатора (например, KX-21N фирмы Sysmex, Кобе, Япония), либо с помощью центрифуги (например, hematokrit 200 фирмы Hettich, Тутлинген, Германия) в тот же день.
Процесс анализа гематокрита
Для каждой пробы измеряется коэффициент отражения чистой фильтровальной бумаги и коэффициент отражения в центре пятна. Для создания калибровки определяется зависимость измеренной интенсивности сигнала на DBS карточке от известных значений гематокрита. Калибровочная кривая аппроксимируется с помощью линейного регрессионного анализа. С использованием полученного уравнения можно определить гематокрит аутентичных образцов на DBS карточках.
Результаты
Если зависимость гематокрита с анализируемым веществом известна, то может быть применен алгоритм нормализации. Подобно нормализации образцов мочи на содержание креатинина, нормализация гематокрит-зависимых аналитов позволяет вводить поправку на гематокрит по выбору. Концентрации у испытуемых мужского и женского пола, которые имеют разные диапазоны гематокрита, могут быть сравнены при одной и той же величине гематокрита. Это может быть в целом интересно для любой оценки, где пороговые концентрации использовались без учета величины гематокрита пробы.
