Метод ВЭТСХ в изучении биологического воздействия химических веществ из частиц шин

Микрочастицы шин и дорожного покрытия (TRWP) образуются в результате истирания шин о поверхность дороги. В настоящее время микрочастицы шин составляют большую часть первичного микропластика, попадающего в окружающую среду. Химические добавки в резинах, потенциальные неизвестные примеси и их продукты реакций вымываются из TRWP в окружающую среду. На сегодняшний день проблема биологического воздействия химических веществ из частиц шин на здоровье человека и окружающую среду вызывает серье

Содержание:

1. Комбинирование ВЭТСХ с биотестами для оценки токсичности микрочастиц шин
2. Метод ВЭТСХ в оценке рисков биологического воздействия химических веществ из частиц шин
   • Растворы стандартов
   • Пробоподготовка
   • Пластины
   • Нанесение
   • Хроматография
   • Постхроматографическая дериватизация
   • Документирование
   • Денситометрия
3. Результаты и обсуждение

Комбинирование ВЭТСХ с биотестами для оценки токсичности микрочастиц шин

На сегодняшний день в рамках посвященного шинной промышленности проекта Tire Industry Project (TIP), финансируемого Всемирным деловым советом по устойчивому развитию (WBCSD), проводятся исследования с целью изучения механизмов биологического воздействия химических веществ из частиц шин, накопления и трофического переноса химических веществ и частиц, а также потенциальных решений указанных проблем. 

В приведенном далее исследовании метод ВЭТСХ был комбинирован с биотестами для оценки эстрогенной активности (YES), генотоксичности (umuC) и ингибирования бактериальной люминесценции (BLIT) для оценки токсичности химических веществ, экстрагированных и выщелоченных из полученной в лаборатории криогенно измельченной шинной смеси (CMTT).

Комбинирование ВЭТСХ с биотестами важно для соблюдения следующих условий:

• высокочувствительного детектирования биологической активности по сравнению с интегральной оценкой смеси компонентов в микропланшетах;
• выявления различий в профиле токсичности (т.е. различий между образцами по их профилям, даже если общая токсичность аналогична);
• сравнения с индивидуальными химическими веществами для их включения или исключения из рассмотрения как потенциально ответственных за токсичность.

Комбинирование ВЭТСХ с биотестами более ограничено в количественной оценке общей токсичности образца из-за большей изменчивости, чем варианты с микропланшетами. Представленная работа была сфокусирована на детектировании и идентификации опасных химических веществ в более высоких концентрациях, чем экологически значимые концентрации CMTT, и заключается в качественной оценке худших сценариев.

Метод ВЭТСХ в оценке рисков биологического воздействия химических веществ из частиц шин

Растворы стандартов

Одиннадцать химических веществ, связанных с применением в производстве шин, были приобретены и растворены в метаноле или ацетоне в концентрациях от 0,5 до 1 г/л. Положительные контроли для биотестов (YES: 0,80 пг 17β-эстрадиола, umuC: 0,31 и 2,5 нг 4-нитрохинолин-N-оксида, BLIT: 630 нг кофеина и 65 нг 3,5-дихлорфенола) добавляли в виде растворов в этаноле, ацетоне или метаноле соответственно.

Пробоподготовка

Протектор шин вырезали из новых шин трех производителей, замораживали и измельчали до микрочастиц (CMTT), затем проводили экстракцию по Сокслету в дихлорметане и метаноле. Остаток подвергали действию модельного раствора пищеварительной жидкости рыб, осадок после отмучивания в воде собирали, получая CMTT с содержанием до 100 г/л суспензии. Водный фильтрат подвергали жидкостно-жидкостной экстракции смесью этилацетат: гексан 9:1 (об/об).

Пластины

Использовали пластины HPTLC plates silica gel 60 размером 20×10 см.

Пробы наносили дозами до 50,0 мкл, а стандарты объемом 5,0 мкл методом распыления с помощью автоматического аппликатора CAMAG ATS 4, длина полосы 6,0 мм, расстояние от левого края 20,0 мм, расстояние между треками 12,0 мм, расстояние от нижнего края 10,0 мм.

Автоматический аппликатор CAMAG ATS 4

Для первичного скрининга для всех тестов элюирование проводили с помощью автоматической камеры CAMAG AMD 2. Фокусировка два цикла с метанолом до дистанции 20,0 мм, затем ацетоном до 40,0 мм, смесью ацетон — этилацетат 3:1 (об/об) до 50,0 мм, этилацетатом до 60,0 мм, смесью этилацетат — н-гексан 2:1 (об/об) до 70,0 мм, смесью этилацетат — н-гексан 1:1 (об/об) до 80,0 мм. Раствор для кондиционирования 10,0 мл 25 % NH4OH в 200,0 мл дистиллированной деионизированной воды. После первичного скрининга программу с AMD 2 модифицировали для улучшения разделения зон с эстрогенной активностью, сгруппированных около фронта растворителя: фокусировка два цикла с метанолом до 20,0 мм, смесью метанол — этилацетат 1:1 (об/об) до 40,0 мм, смесью этилацетат — н-гексан 1:1 (об/об) до 60,0 мм, смесью этилацетат — н-гексан 1:9 (об/об) до 80,0 мм.

Автоматическая камера CAMAG AMD 2

Постхроматографическая дериватизация

Суспензии дрожжей (YES) или бактерий (umuC и BLIT) распыляли с помощью дериватизатора CAMAG Derivatizer (красное сопло, уровень 6). Для YES и umuC раствор 4-метилумбеллиферилгалактопиранозида (MUG) распыляли после 3-х или 2-х часов инкубации при 30°C или 37°C, соответственно.

Дериватизатор CAMAG Derivatizer

Документирование

Документирование биотестов YES и umuC проводили с помощью системы для документирования и оценки CAMAG TLC Visualizer в режиме УФ 366 нм. Биолюминесценцию (BLIT) регистрировали сразу после распыления бактерий с помощью камеры Bioluminizer, используя экспозицию в течение 1 минуты.

Система для документирования и оценки CAMAG TLC Visualizer

Денситометрия

Дополнительно: сканирование в режиме флуоресценции (для umuC и YES) с помощью спектроденситометра CAMAG TLC Scanner 4 и ПО visionCATS при 366>/400 нм (ртутная лампа), размер щели 5,00 мм x 0,20 мм, скорость сканирования 20 мм/с.

Спектроденситометр CAMAG TLC Scanner 4

Результаты и обсуждение

Показаны снимки треков экстрактов, дигестатов и элюатов для биотестов HPTLC-YES. Вещества с эстрогенной активностью присутствуют во всех экстрактах и элюатах CMTT. Схожие параметры удерживания между некоторыми зонами в пробах предполагают, что это схожие химические вещества, которые отвечают за такую активность, однако относительная интенсивность зон варьировалась.

Снимки треков экстрактов микрочастиц шин, дигестатов и выщелачиваний воды/осадка. (A) Скрининг эстрогенной активности (Yeast estrogen screen, YES), положительный контроль: 17β-эстрадиол 4 пг. B) umuC, положительный контроль: 4-нитрохинолин-N-оксид 2,5 нг. (C) Тест ингибирования бактериальной люминесценции (Bacterial luminescence inhibition test, BLIT), положительный контроль: кофеин 625 нг. Экстракт криогенно измельченного протектора шин после экстракции по Сокслету (Cryogenically milled tire tread, CMTT) в эквиваленте 0,5 мг CMTT (YES), 1 мг (umuC) и 0,5 мг (BLIT). Водные образцы (дигестаты, вода и выщелачивания осадка и соответствующие контрольные образцы) экстрагировали жидкостно-жидкостной экстракцией смесью этилацетат:н-гексан перед ВЭТСХ и наносили в эквиваленте 5 мг CMTT. 

Холостая проба, представляющая фоновые вещества из модельного раствора пищеварительной жидкости, также проявляла эстрогенную активность. Профиль токсичности холостой пробы продукта расщепления показывает, какие «пятна» в продукте дигестатов CMTT происходят из материалов для дигестатов, а не из микрочастиц CMTT. Одно пятно в продукте дигестатов CMTT с R_F = 0,7 с большой вероятностью является компонентом микрочастиц CMTT и может оставаться на пластине совместно с фоновыми эстрогенами продукта дигестатов. Мы связали эстрогенную активность холостой пробы с биологическими компонентами продуктов дигестатов: свиной желчью и панкреатином. ВЭТСХ позволила нам отличить часть этого фона от химических веществ, поступающих из CMTT. Также могут быть и другие химические вещества из CMTT, «скрытые» интенсивным сигналом «эстрогенной активности» продуктов дигестатов.

Снимки треков тестов ВЭТСХ-YES искусственного продукта расщепления и его компонентов. HEPES (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота), 0,04 М), панкреатин (4 мг/мл в растворе соли), экстракт свиной желчи (10 мг/мл в растворе электролита) и пепсин (5 мг/мл в 0,25 М HCl), приготовленных по отдельности, следуя образцу в методике Masset et al. Панкреатин, экстракт свиной желчи и пепсин пропускают через ПТФЭ фильтры 0,45 мкм для удаления взвеси, затем обрабатывают жидкостно-жидкостной экстракцией (LLE), как описано в основном тексте. Экстракты (50 мкл) наносят на пластины для ВЭТСХ. 

Десять из одиннадцати химических веществ были активны, по крайней мере, в одном биотесте. Некоторые из этих химических веществ имели схожие параметры удерживания с зонами из экстрактов проб CMTT. Например, некоторые бензотиазолы и 6PPD имеют R_F в области 0,7–0,85. Эти результаты помогают вовлечь бензотиазолы в качестве факторов токсичности CMTT для бактерий in vitro. Однако необходимо подтвердить, что отдельные бензотиазолы являются такими токсикантами, возможно, путем химического анализа активных зон CMTT. Впоследствии любой риск для организмов в окружающей среде потребует оценки экологически значимых концентраций и количественного токсикологического анализа.

Комбинирование ВЭТСХ с тестом ингибирования бактериальной люминесценции активных индивидуальных химических веществ по сравнению с образцами криогенно измельченного протектора шин. Количества химических веществ номинально составляют 0,55 мкг (HBT), 0,50 мкг (ABT), 5,15 мкг (BT), 0,5 мкг (MTBT), 0,66 мкг (SBT), 0,7 мкг (6PPD), 0,14 мкг (MBTS) и 4,2 мкг (ANI). CMTT = криогенно измельченный протектор шин (cryogenically milled tire tread); HBT = 2-гидроксибензотиазол; ABT = 2-аминобензотиазол; BT = бензотиазол; MTBT = 2-(метилтио)бензотиазол; SBT = 2-меркаптобензотиазол; 6PPD = N-(1,3-диметилбутил)-N′-фенил-п-фенилендиамин; MBTS = 2-2′-дитиобисбензотиазол; ANI = анилин. 

Приведенная работа является ранним этапом в процессе оценки рисков, расширяющим понимание потенциальных опасностей от частиц шин и определяющим приоритетность изучения химических веществ как потенциально ответственных за их воздействие.

Глювекс предлагает своим клиентам широкий выбор оборудования CAMAG. С подробным каталогом вы можете ознакомится в разделе производителя. Для заказа приборов оставьте заявку по адресу sales@gluvex.com или свяжитесь с нами по телефону 8 (495) 291-39-19.

• Подписывайтесь на наш Telegram-канал, чтобы быть в курсе новостей сервисного центра Глювекс и новых поступлений на склад, полезных и интересных публикаций на тему лабораторного оборудования и расходных материалов.