Высокоэффективная тонкослойная хроматография. Основные принципы и преимущества, отличия ВЭТСХ от обычной ТСХ

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) появилась в результате развития классической тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для фармацевтической отрасли ВЭТСХ представляет интерес благодаря сочетанию нескольких характеристик: возможности одновременно анализировать большое количество образцов, гибкости методики и широких возможностей автоматизации. Метод применяется для идентификации компонентов, контроля качества, анализа примесей и продуктов деградации, исследования стабильности и анализа сложных многокомпонентных объектов. В приведенном материале разбираем основные принципы метода, из каких модулей собирается система и в каких задачах ВЭТСХ выигрывает у альтернатив.

Содержание:

1. Что такое ВЭТСХ
2. Основные этапы процесса ВЭТСХ

2.1. Подготовка образца

2.2. Нанесение образца

2.3. Элюирование

2.4. Дериватизация

2.5. Детектирование и количественная оценка

3. ВЭТСХ в фармацевтической отрасли
4. Сравнение ТСХ и ВЭТСХ
5. Количественный анализ методом ВЭТСХ
6. Из чего состоит система ВЭТСХ CAMAG
7. Преимущества перехода на ВЭТСХ
8. Как выглядит переход от обычной ТСХ к автоматизированной ВЭТСХ
9. Когда ВЭТСХ особенно выгодна фармацевтической лаборатории
10. Преимущества оборудования CAMAG​

Что такое ВЭТСХ

ВЭТСХ представляет собой метод разделения веществ в тонком слое сорбента на пластине. При ВЭТСХ используются пластины с мелким сорбентом узкого гранулометрического состава (обычно силикагель со средним размером частиц около 5 мкм и толщиной слоя 200 мкм). 

Образец наносится на пластину, после чего пластина помещается в хроматографическую камеру. Под действием капиллярных сил подвижная фаза перемещается по слою сорбента и переносит компоненты смеси с различной скоростью. В результате формируется хроматограмма. Результат фиксируется как цифровой снимок в трех режимах освещения и, при необходимости, как денситограмма. Все параметры и данные хранятся в программе, обеспечивающей прослеживаемость. Одна пластина 20 на 10 см вмещает 15 и более треков, которые проходят разделение одновременно и в одинаковых условиях. 

Ключевое отличие ВЭТСХ заключается в стандартизации и контроле всех основных стадий анализа: нанесения образца, элюирования, визуализации/детектирования и обработки результатов. CAMAG предлагает оборудование для последовательного и полного процесса ВЭТСХ, включающего нанесение образца элюирование, дериватизацию и детектирование. Уровень автоматизации каждого этапа подбирается в зависимости от требований лаборатории к точности, производительности и воспроизводимости.

​

Основные этапы процесса ВЭТСХ

Типичный ВЭТСХ-анализ можно представить как последовательность нескольких операций. Каждый этап, от подготовки сорбента и нанесения пробы до элюирования и детектирования, влияет на эффективность разделения и воспроизводимость результатов.  Точность анализа в ВЭТСХ напрямую зависит от соблюдения технологии на каждой стадии.​

Подготовка образца

Исследуемый препарат, субстанция или промежуточный продукт переводится в раствор. В зависимости от задачи может потребоваться экстракция, фильтрация, центрифугирование или другие операции пробоподготовки.​

Нанесение образца

На пластину наносят исследуемые растворы и стандартные образцы.

Именно на этом этапе особенно важна воспроизводимость. При ручном нанесении результат может зависеть от оператора, объема нанесенного раствора, положения пятна и других факторов.

В автоматизированной системе CAMAG ATS 4 (Automatic TLC Sampler 4) образцы наносятся автоматически в виде пятен, полос или прямоугольных зон. Для количественного анализа особенно важно нанесение в виде узких полос. Такая геометрия стартовой зоны способствует получению максимально эффективного разделения. ATS 4 использует spray-on нанесение и управляется через ПО visionCATS.

​

Элюирование

После нанесения пластина помещается в камеру с подвижной фазой. В автоматизированной системе CAMAG эту операцию может выполнять камера для элюирования ADC (Automatic Developing Chamber). Например, ADC 2 или современная ADC 3 обеспечивают воспроизводимое и полностью автоматическое элюирование, независимое от условий окружающей среды, что повышает воспроизводимость процесса. В фармацевтических методиках CAMAG используются контролируемые условия насыщения камеры, влажности, активации пластины и расстояния элюирования. ​

Дериватизация

Некоторые вещества плохо обнаруживаются непосредственно после хроматографического разделения. В таком случае применяется процедура дериватизации, обеспечивающая обработку зон специальным реагентом, который образует окрашенное или флуоресцирующее производное. Это расширяет область применения ВЭТСХ, особенно при анализе природных соединений, фармацевтических препаратов и сложных многокомпонентных смесей.​

Детектирование и количественная оценка

Полученная хроматограмма визуализируется с использованием TLC Visualizer, либо измеряется денситометрически с помощью TLC Scanner 4. В результате появляется возможность не только увидеть наличие конкретных зон, но и провести их количественную оценку._В фармацевтической

ВЭТСХ в фармацевтической отрасли

В фармацевтическом производстве метод может использоваться на разных этапах жизненного цикла препарата.

Контроль качества. ВЭТСХ позволяет сравнивать исследуемый образец со стандартом и оценивать соответствие профиля компонентов. Так, можно анализировать: действующее вещество, вспомогательные вещества, продукты разложения, технологические примеси, сопутствующие компоненты, многокомпонентные препараты.

Анализ примесей. Одна из важных задач фармацевтической аналитики заключается в контроле примесного профиля. На одной пластине можно одновременно разделять несколько компонентов и сравнивать их зоны с соответствующими стандартами. CAMAG приводит примеры HPTLC-методик, в которых одновременно разделяются фармацевтические субстанции и родственные примеси. 

Исследование стабильности. ВЭТСХ может применяться для контроля изменений состава препарата при хранении. Сравнение хроматограмм образцов, взятых в разные моменты времени или после воздействия различных условий, позволяет отслеживать появление новых зон и изменение содержания исходных компонентов.

Контроль технологического процесса. Метод может использоваться для анализа промежуточных продуктов синтеза, контроля процесса очистки и других технологических задач. CAMAG отдельно отмечает применение HPTLC в фармацевтике для process control, quality control, impurity profiling и cleaning validation.​

Сравнение ТСХ и ВЭТСХ

ВЭТСХ не является принципиально другим хроматографическим методом, а представляет собой более стандартизированную и высокоэффективную реализацию ТСХ. Принципиальное различие между двумя методами начинается с самой хроматографической пластины. В классической ТСХ используется сорбент с размером частиц 10–15 мкм, с широким распределением по размеру, толщина слоя обычно составляет 250 мкм. В пластинах ВЭТСХ размер частиц сорбента уменьшен до 5–7 мкм, распределение по размеру узкое, форма частиц более правильная (близкая к сферической), а толщина слоя снижена до 100–200 мкм. ТСХ, отличающаяся простотой и доступностью, подходит для быстрого скрининга и качественного анализа. ВЭТСХ благодаря меньшему размеру частиц и автоматизации операций обеспечивает более высокую чувствительность, разрешение и воспроизводимость, что делает ее пригодной для количественного анализа и стандартизированных методик.

​

Количественный анализ методом ВЭТСХ

Возможность количественного анализа считается одним из принципиальных преимуществ инструментальной ВЭТСХ.

Схематично процесс выглядит следующим образом: стандарт → нанесение → разделение → детектирование → измерение сигнала → расчет содержания

Для количественного определения готовят серию стандартных растворов с известной концентрацией. Стандарты и исследуемые образцы наносят на одну пластину, разделяют в одинаковых условиях, после чего измеряют аналитический сигнал соответствующих зон.

При денситометрии оценивается интенсивность сигнала зоны. В зависимости от метода детектирование может проводиться по поглощению или флуоресценции. На основании серии стандартов строится градуировочная зависимость, после чего по сигналу исследуемого образца рассчитывается содержание определяемого вещества. Условно: сигнал зоны → градуировочная зависимость → концентрация вещества

Именно автоматизация нанесения и стандартизация элюирования особенно важны для количественного анализа: если объем нанесения или условия элюирования нестабильны, это непосредственно отражается на качестве количественного результата.​

Из чего состоит система ВЭТСХ CAMAG

Система подбирается индивидуально для каждой лаборатории как комбинация модулей под конкретную аналитическую задачу. Базовую автоматизированную конфигурацию можно представить так: ATS 4 → ADC → TLC Visualizer/TLC Scanner 4 → visionCATS

ATS 4. Автоматическое нанесение. Automatic TLC Sampler 4 отвечает за первый критически важный этап нанесения образцов и стандартов. Прибор может наносить растворы в виде полос, пятен или прямоугольников и поддерживает автоматизированное последовательное нанесение. ATS 4 рассчитан в том числе на рутинные задачи и высокий поток образцов.

ADC. Автоматическое элюирование. Automatic Developing Chamber обеспечивает контролируемое элюирование хроматографической пластины. Автоматизация этого этапа позволяет стандартизировать такие параметры, как подготовка камеры, условия насыщения и элюирование пластины. Для современных систем CAMAG доступна, ADC 3. Производитель указывает ее применение для воспроизводимого изократического элюирования HPTLC-пластин 20×10 см.

TLC Visualizer. Визуализация. TLC Visualizer используется для получения цифровых изображений хроматограммы при различных условиях освещения. Это особенно полезно для документирования результатов и визуальной оценки разделения.

TLC Scanner 4. Количественная оценка. Если задача лаборатории предусматривает инструментальный количественный анализ, в систему может быть включен TLC Scanner 4. Прибор позволяет проводить денситометрическую оценку разделенных зон.

ПО visionCATS. Управление и обработка данных. Программная платформа visionCATS объединяет работу совместимых компонентов системы, обеспечивает управление приборами и работу с данными анализа.​

Преимущества перехода на ВЭТСХ

Главное преимущество для лаборатории при переходе на ВЭТСХ заключается в стандартизации метода. Переход от классической тонкослойной хроматографии к высокоэффективной затрагивает все ключевые характеристики анализа: эффективность разделения, чувствительность детектирования, воспроизводимость и пропускную способность. Среди основных отличительных особенностей можно выделить следующие: 

• Повышение воспроизводимости. Автоматизированное нанесение позволяет точно контролировать объем и положение образца на пластине. Например, ATS 4 способен автоматически наносить образцы в виде полос с заданными параметрами.
• Увеличение производительности. На одной пластине можно одновременно анализировать большое количество образцов и стандартов, что особенно важно для лабораторий контроля качества, где необходимо регулярно исследовать большие серии проб.
• Возможность количественного анализа. Инструментальная ВЭТСХ позволяет перейти от ответа: «компонент присутствует» к вопросу: «сколько компонента содержится в образце». Для этого используется денситометрическая оценка зон.
• Снижение влияния оператора. Чем больше ручных операций содержит методика, тем выше риск вариабельности результатов. Автоматизация позволяет зафиксировать параметры процесса и воспроизводить их от анализа к анализу.
• Цифровая регистрация результатов. Современная система позволяет не только получить хроматограмму, но и сохранить параметры метода, изображения и результаты обработки. В экосистеме CAMAG эту задачу выполняет visionCATS, программное обеспечение для управления совместимыми приборами и обработки HPTLC-данных. ПО поддерживает работу, в частности, с ATS 4, ADC 2/3, TLC Visualizer и TLC Scanner 4.​

Как выглядит переход от обычной ТСХ к автоматизированной ВЭТСХ

Развитие технологии можно представить в три этапа.

Этап 1. Классическая ТСХ

Ручное нанесение → ручное элюирование → визуальная оценка

Преимущество заключается в простоте и невысокой стоимости.

Среди недостатков следует отметить значительное влияние оператора и ограниченные возможности воспроизводимого количественного анализа.

Этап 2. Инструментальная ТСХ

Стандартизированное нанесение → контролируемое элюирование → инструментальное детектирование

Лаборатория получает более высокую воспроизводимость и возможность количественной обработки.

Этап 3. Автоматизированная ВЭТСХ

ATS 4 → ADC → Derivatizer → TLC Scanner / TLC Visualizer → visionCATS

Комплексный аналитический процесс с автоматизацией ключевых стадий.​

Когда ВЭТСХ особенно выгодна фармацевтической лаборатории

Лаборатории стоит рассматривать ВЭТСХ стоит рассматривать в случаях, когда необходимо выполнение следующих задач:

• анализ большого количества образцов;
• одновременное сравнение образцов и стандартов;
• воспроизводимые хроматографические профили;
• количественное определение;
• контроль примесей и продуктов деградации;
• исследование многокомпонентных препаратов;
• сокращение количества ручных операций;
• документируемость аналитического процесса и соответствие современным требованиям;
• один аналитический подход для различных задач.

При этом переход на ВЭТСХ не означает, что классическая ТСХ становится ненужной. Для простых идентификационных задач ручная ТСХ может оставаться рациональным и экономичным решением. ВЭТСХ имеет наибольшую ценность там, где важны воспроизводимость, производительность, количественная оценка и стандартизация.

​

Преимущества оборудования CAMAG

CAMAG предлагает оборудование для различных стадий ВЭЖХ-процесса и позволяет формировать систему в соответствии с задачами конкретной лаборатории.

Так, для лаборатории с большим количеством образцов может быть актуальна конфигурация с ATS 4 + ADC + TLC Scanner 4 + visionCATS, дополненная TLC Visualizer при необходимости визуальной документации. CAMAG также предлагает готовые системные конфигурации для количественного анализа с высокой производительностью.

При этом состав системы не обязательно должен быть одинаковым для всех лабораторий. Оптимальная конфигурация зависит от того, какие вещества анализируются, сколько образцов проходит через лабораторию, требуется ли количественный анализ, какие методы детектирования используются и насколько глубокой должна быть автоматизация.

Специалисты Глювекс помогут определить оптимальную конфигурацию оборудования от автоматического нанесения ATS 4 и автоматического элюирования ADC до инструментального детектирования TLC Scanner 4/TLC Visualizer и программного обеспечения visionCATS. 

Глювекс предлагает своим клиентам широкий выбор оборудования CAMAG. С подробным каталогом вы можете ознакомится в разделе производителя. Свяжитесь с нами, чтобы подобрать систему ВЭТСХ CAMAG под ваши задачи, по адресу sales@gluvex.com или по телефону 8 (495) 291-39-19.

Подписывайтесь на наш Telegram-канал, чтобы быть в курсе новостей сервисного центра Глювекс и новых поступлений на склад, полезных и интересных публикаций на тему лабораторного оборудования и расходных материалов.

Статью подготовил Антон Екимов, продакт-менеджер продукции CAMAG