ГОСТ Р 53152-2008 Продукты пищевые. Определение содержания полициклических ароматических углеводородов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Группа Н19    

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение содержания полициклических ароматических углеводородов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Food products. Determination of PAHs content by HPLC method

ОКС 67.080.10
ОКСТУ 9109

Дата введения 2010-01-01

     
     
Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1. РАЗРАБОТАН Атлантическим научно-исследовательским институтом рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП "Атлант НИРО")
   
   
2. ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
   
   
3. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. N 590-ст
   
   
4. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на продовольственное сырье и пищевые продукты и устанавливает метод определения массовых долей полициклических ароматических углеводородов с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 7631-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний

ГОСТ 8756.0-70 Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытаниям

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 9968-86 Метилен хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 20289-74 Реактивы. Диметилформамид. Технические условия

ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008, здесь и далее по тексту. 

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29228-91 (ИСО 835-80) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 полициклические ароматические углеводороды; ПАУ: Группа органических полициклических соединений, молекулы которых построены из конденсированных бензольных ядер (двух и более), а также включающие пятичленные циклы.

4. Отбор проб

Отбор и подготовку лабораторной пробы к испытаниям проводят в соответствии с ГОСТ 7631, ГОСТ 8756.0

Допускается хранить подготовленную пробу в замороженном состоянии без доступа кислорода при температуре не выше 18 °С не более 7 сут.

Из объединенной лабораторной пробы для испытания отбирают две параллельные навески.

5. Сущность метода

Сущность метода заключается в щелочном гидролизе пробы, экстракции углеводородов гексаном из гидролизованного продукта, селективном выделении фракции полициклических ароматических углеводородов диметилформамидом, повторной экстракции ПАУ гексаном из разбавленного водного раствора диметилформамида, очистке полученной фракции от мешающих примесей на колонке с сефадексом или силикагелем с последующим количественным определением выделенных углеводородов высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Метод позволяет провести определение 16 веществ (приоритетных загрязнителей по ЕРА).

Предел обнаружения массовых долей ПАУ в анализируемых продуктах составляет от 0,1 до 5 мкг/кг для различных ПАУ.

6. Средства измерений, оборудование, реактивы, материалы

• Хроматограф жидкостный любой марки с флуориметрическим детектором (диапазон длин волн возбуждения 230-280 нм, диапазон длин волн регистрации 310-500 нм) с программным обеспечением для регистрации и обработки хроматограмм.
  
  
• Колонка хроматографическая для ВЭЖХ длиной 150-250 мм и диаметром 2,1-4,6 мм с обращенной фазой С18 специально предназначенная для разделения ПАУ, имеющая эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пикам ПАУ.
  
  
• Баня водяная лабораторная любой марки, имеющая диапазон температур от 20 °С до 100 °С.
  
  
• Весы лабораторные общего назначения высокого или специального класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 или 210 г и ценой деления 0,1 мг по ГОСТ 24104.
  
  
• Испаритель ротационный любой марки.
  
  
• Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.
  
  
• Дефлегматор 250-19/26-29/32 ТС по ГОСТ 25336.
  
  
• Воронка делительная ВД-1-250 и ВД-1-500 по ГОСТ 25336.
  
  
• Воронка стеклянная ВФО 100-14/23 по ГОСТ 25336.
  
  
• Воронка Бюхнера по ГОСТ 9147.
  
  
• Колбы конические 1-250, 1-500 по ГОСТ 25336.
  
  
• Колба градуированная 50-14/23 по ГОСТ 25336.
  
  
• Колбы мерные 2-10-2, 2-100-2, 2-200-2 по ГОСТ 25336.
  
  
• Колонка хроматографическая стеклянная длиной не менее 20 см и диаметром 1,0 см с резервуаром вместимостью не менее 20 см³.
  
  
• Микрошприцы хроматографические двух видов: на 10 мкл с ценой деления 0,1 мкл и на 100 мкл с ценой деления 1,0 мкл.
  
  
• Пипетки 1-1-1, 1-1-2, 2-1-5 по ГОСТ 29228.
  
  
• Стакан химический В-1-100 или В-1-150 по ГОСТ 25336.
  
  
• Стаканы для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 25336.
  
  
• Цилиндры мерные 1-100, 1-250 или 3-100, 3-250 по ГОСТ 25336.
  
  
• Холодильник водяной по ГОСТ 25336.
  
  
• Азот газообразный по ГОСТ 9293.
  
  
• Ацетонитрил по [1], ос.ч.
  
  
• Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
  
  
• Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
  
  
• н-Гексан по [2], ос.ч.
  
  
• Диметилформамид по ГОСТ 20289, х.ч.
  
  
• Калия гидроокись по ГОСТ 24363, х.ч.
  
  
• Натрий сернокислый, безводный, по ГОСТ 4166.
  
  
• Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
  
  
• Силикагель, размер частиц 60-200 мкм, импортный.
  
  
• Хлористый метилен по ГОСТ 9968, х.ч.
  
  
• Стандартные образцы состава раствора в ацетонитриле определяемых ПАУ массовой концентрации 100 или 200 мкг/см³ и погрешностью аттестованного значения не более ±2% или чистые вещества, массовая доля основного вещества не менее 98%.
  
  
• Волокнистый кварцевый материал СКВ по [3].
  
  
• Шпатели, стеклянные палочки, стеклянные капилляры.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также других реактивов и материалов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

7. Проведение испытаний

7.1 Подготовка к испытанию

7.1.1 Очистка растворителей

Растворители при необходимости перегоняют общепринятым способом.

7.1.2 Приготовление исходных растворов индивидуальных ПАУ


В бюксы отвешивают по (10,0±0,1) мг каждого индивидуального ПАУ. Навески количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, затем объем раствора доводят до метки ацетонитрилом.

При использовании ГСО состава раствора в ацетонитриле массовой концентрацией 200 мкг/см³ отбирают 1 см³ и смешивают с равным объемом ацетонитрила.

Полученные растворы имеют массовую концентрацию 100 мкг/см³. Растворы хранят плотно закрытыми в темном холодном месте не более 3 мес.

7.1.3 Приготовление рабочих растворов индивидуальных ПАУ

Отбирают 0,5 см³ исходного раствора индивидуального ПАУ в мерную колбу вместимостью 10 см³ и объем раствора доводят до метки ацетонитрилом. Полученные рабочие растворы имеют массовую концентрацию 5 кг/см³. Рабочие растворы допускается хранить плотно закрытыми в темном месте при температуре 4 °С - 6 °С не более одного месяца.

7.1.4 Приготовление градуировочных растворов

Для приготовления градуировочных растворов смеси индивидуальных ПАУ в мерные колбы вместимостью 100 см³ переносят приведенные в таблице 1 объемы рабочих растворов индивидуальных ПАУ массовой концентрацией 5 мкг/см³, затем доводят объем до метки ацетонитрилом. Градуировочные растворы допускается хранить плотно закрытыми в темном месте при температуре 4 °С - 6 °С не более одного месяца.

Таблица 1

7.1.5 Градуировка хроматографа

Градуировку хроматографа выполняют, используя градуировочные растворы, приготовленные по 7.1.4, с добавлением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют бенз(b)хризен.

В условиях, позволяющих разделить все составные вещества калибровочной смеси (см. 7.2.4.1), записывают не менее трех хроматограмм для каждого градуировочного раствора.

Определяют среднеарифметическое значение площади пиков каждого индивидуального ПАУ, рассчитанное из трех хроматограмм.

Отдельно записывают не менее двух хроматограмм для каждого индивидуального ПАУ для определения времени удерживания, используя рабочие растворы, приготовленные по 7.1.3, объем инжекции 1-2 мкл. Стабильность времени удерживания считают удовлетворительной при расхождении между двумя значениями не более 5%.

Градуировочный коэффициент , определяемый экспериментально в зависимости от выбранных условий детектирования по хроматограмме стандартной смеси ПАУ, включающей бенз(b)хризен, для каждого индивидуального ПАУ рассчитывают по формуле

где  - масса введенного индивидуального ПАУ, мкг;

 - площадь пика внутреннего стандарта, усл. ед.;

 - масса внутреннего стандарта, мкг;

 - площадь пика индивидуального ПАУ, усл. ед.

Градуировочный коэффициент  рассчитывают для каждого индивидуального ПАУ. Его значения не должны отличаться от среднеарифметического более чем на 10%.

7.1.6 Подготовка хроматографических колонок для очистки проб

7.1.6.1 Заполнение колонки силикагелем

Силикагель предварительно подвергают дезактивации. Для этого к 50 гсиликагеля, прокаленного при температуре 180 °С-200 °С, добавляют 3% (по массе) дистиллированной воды по капле и интенсивно встряхивают после добавления каждой капли. Затем оставляют в эксикаторе на время не менее 18 ч для дезактивации. После дезактивации заполняют колонку силикагелем массой (10,0±0,1) г, осторожно по стенке колонки заливают 25 см³ н-гексана, дают стечь н-гексану, не допуская высыхания верхнего слоя. Заполнять колонку необходимо очень аккуратно во избежание взмучивания и неравномерного заполнения колонки. Колонку готовят непосредственно перед очисткой и не используют повторно.

Каждую новую партию сорбента перед использованием необходимо проверить на качество деления. Для этого через колонку с подготовленным сорбентом пропускают 1 см³ градуировочного раствора N 2 или N 3 с добавлением очищенного экстракта рабочей пробы по 7.2, проводят процедуру очистки по 7.2.2, после чего анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все индивидуальные ПАУ (особенно наиболее легкие и наиболее тяжелые), входящие в состав градуировочного раствора, не должны быть потеряны или перекрываться пиками мешающих их определению веществ. При неудовлетворительных результатах либо меняют партию сорбента, либо подбирают условия очистки, варьируя объем отбрасываемой фракции и элюата.

7.1.6.2 Заполнение хроматографической колонки сефадексом LH-20
(4,0±0,1) г сефадекса марки LH-20 взвешивают на аналитических весах и заливают 50 см³ этилового спирта, выдерживают для набухания не менее 3 ч, после чего осторожно переносят в колонку. Колонку необходимо заполнять одномоментно во избежание неравномерного заполнения колонки. Дают стечь спирту до высоты 1-2 мм над верхним слоем сорбента, после чего вносят экстракт.

Заполненную колонку допускается хранить и использовать повторно. Для повторного использования необходимо промыть колонку 50 мл этилового спирта. Для хранения необходимо заполнить колонку этиловым спиртом, закупорить колонку пробкой и не допускать высыхания сорбента. В случае высыхания сефадекса рекомендуется приготовить новую колонку.

7.1.6.3 Приготовление раствора гидроокиси калия в этиловом спирте

В колбу вместимостью 150-200 см³ помещают (8,0±0,1) г гидроксида калия, добавляют 2 см³ дистиллированной воды и 98 см³ этилового спирта, перемешивают до полного растворения.

7.2 Проведение испытаний

7.2.1 Выделение ПАУ из продукта

Навеску продукта массой 10,0-20,0 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ спиртового раствора гидроокиси калия. Содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Затем в пробу продукта и пробу контрольного опыта вносят по 10 мкл внутреннего стандарта - рабочего раствора бенз(b)хризена, приготовленного по 7.1.2 массовой концентрацией 5 мкг/см³. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре 85 °С-90 °С в течение 3 ч. Затем в колбу через холодильник добавляют 100 см³ дистиллированной воды. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и после охлаждения переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³. В случае если после гидролиза в реакционной массе остался нерастворимый осадок, его отделяют на воронке Бюхнера, промывая на фильтре 30 см³ горячего этилового спирта. Спирт после промывки добавляют в делительную воронку с реакционной смесью. В делительную воронку также добавляют 30 см³ н-гексана. Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин и оставляют для расслаивания. В случае образования эмульсии к смеси в делительной воронке добавляют 10-20 см³ этилового спирта. После расслаивания нижнюю водно-спиртовую фазу сливают в колбу, а верхний гексановый слой переливают в другую делительную воронку. Затем повторяют экстракцию ПАУ из водно-спиртовой фракции н-гексаном еще два раза по 30 см³. Гексановые экстракты объединяют в делительной воронке и промывают дистиллированной водой трижды по 30 см³, после чего экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбу вместимостью 100 см³. Раствор выпаривают на ротационном испарителе до объема 50 см³ при температуре водяной бани не выше 50 °С.

Упаренный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³ и добавляют к нему 50 см³ смеси диметилформамида с водой в соотношении 9:1. Интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин, после расслаивания фаз нижнюю сливают в плоскодонную колбу, а верхний гексановый слой снова подвергают экстракции, добавляя 50 см³ смеси диметилформамида и воды. Гексановый слой отбрасывают, объединенный диметилформамидный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ дистиллированной воды, встряхивают и проводят экстракцию из водной фазы н-гексаном трижды по 50 см³. Водную фазу отбрасывают, а гексановый экстракт промывают водой три раза по 30 см³, переносят в плоскодонную колбу, добавляют 10 г безводного сульфата натрия и выдерживают в течение 1 ч, после чего фильтруют в круглодонную колбу. н-Гексан выпаривают на ротационном испарителе до объема 1,0 см³ и остаток очищают на колонке с дезактивированным силикагелем (см. 7.2.2) или осторожно упаривают досуха потоком воздуха через вакуумный аллонж, соединенный с водоструйным насосом, остаток в колбе растворяют в 0,5 см³ этилового спирта и очищают на колонке с сефадексом (см. 7.2.3).

Одновременно проводят холостой опыт, проводя все стадии анализа с использованием реактивов по 7.2, но без навески продукта.

7.2.2 Очистка экстракта на хроматографической колонке с силикагелем

На подготовленную по 7.1.6.1 колонку с дезактивированным силикагелем пипеткой количественно переносят гексановый экстракт, полученный по 7.2.1, трижды промывая колбу гексаном по 0,5 см³. Первую фракцию элюируют 25 см³ гексана и отбрасывают, вторую фракцию (ПАУ) элюируют 60 см³ смеси гексана и хлористого метилена в объемном соотношении 1:4. Полученный элюат упаривают на роторном испарителе до объема 2,0 см³ (но не менее 1,5 см³) при температуре не выше 50 °С, оставшийся растворитель удаляют потоком воздуха через вакуумный аллонж, соединенный с водоструйным насосом. Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ ацетонитрила.

Далее выполняют количественный анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

7.2.3 Очистка экстракта на хроматографической колонке с сефадексом LH-20

На подготовленную по 7.1.6.2 колонку пипеткой наносят экстракт, полученный по 7.2.1 в 0,5 см³ этилового спирта, трижды смывая его из колбы этиловым спиртом порциями по 0,5 см³. Элюирование из колонки ПАУ проводят этиловым спиртом, первую фракцию 15 см³ отбрасывают, собирают следующую фракцию объемом 40 см³ в грушевидную колбу объемом 100 см³. Спирт упаривают на роторном испарителе до объема не менее 0,5 см³ при температуре не выше 50 °С, а остаток удаляют в потоке воздуха или азота. Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ ацетонитрила.

Далее выполняют количественный анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

7.2.4 Определение содержания индивидуальных ПАУ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

7.2.4.1 Условия хроматографии

Условия проведения хроматографического анализа подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки. Хроматографическая колонка должна быть специально предназначена для разделения ПАУ. Критерием возможности применения можно считать разделение на колонке таких пар индивидуальных ПАУ, как бенз(а)антрацен и хризен, а также бенз(g,h,i)перилен и индено(1,2,3-сd)пирен, которые на обычных колонках не делятся.

В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения ПАУ, выполненного на жидкостном хроматографе Shimadzu 2010A, колонке ChromSep CP EcoSpher 4 PAH 250x3,0.

Подвижная фаза: ацетонитрил, вода.

Градиент: 3 мин ацетонитрил: вода (60:40), следующие 12 мин ацетонитрил от 60% до 100% и далее 100% ацетонитрил до окончания анализа.

Режим программирования по времени длин волн возбуждающего света и регистрации пиков приведен в таблице 2.

Таблица 2

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

7.2.4.2 Проведение измерений


Пробу продукта и пробу контрольного опыта хроматографируют дважды и рассчитывают среднеарифметическое значение площади пиков анализируемых полициклических ароматических углеводородов, включая внутренний стандарт.

8. Обработка результатов испытаний

На основании полученных данных рассчитывают массовую концентрацию каждого индивидуального ПАУ, мг/кг, в продукте по формуле 

где  - масса внутреннего стандарта, введенного в пробу продукта и пробу контрольного образца, мкг;

 - градуировочный коэффициент, установленный экспериментально в процессе градуировки и рассчитанный по формуле (1);

 - площадь пика индивидуального ПАУ на хроматограмме пробы продукта, усл. ед.;

 - площадь пика индивидуального ПАУ на хроматограмме пробы контрольного образца, усл. ед.;

 - масса навески, взятая для анализа, г;

 - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме пробы продукта, усл. ед.;

 - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме пробы контрольного образца, усл. ед.

Результат анализа представляют в виде , мг/кг при 0,95,

где  - среднеарифметическое двух параллельных определений;

 - граница интервала, в котором абсолютная погрешность измерений находится с доверительной вероятностью 0,95.

Характеристику погрешности вычисляют по формуле 

где  - граница интервала, в котором относительная погрешность измерений находится с доверительной вероятностью 0,95%.

Расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать следующей разности

где ,  и  - результаты двух параллельных определений и их среднеарифметическое значение;

 - предел повторяемости, %.

В противном случае испытания повторяют до получения удовлетворительных результатов. Результаты округляют до второй значащей цифры. За окончательный результат испытания  принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений  и  с тем же числом значащих цифр.

9. Метрологические характеристики

Метод обеспечивает получение результатов измерения с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, приведенных в таблице 3.

Таблица 3 (В процентах)

10. Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

• всю информацию, необходимую для исчерпывающей идентификации пробы;
  
  
• метод испытаний и определяемый элемент со ссылкой на настоящий стандарт;
  
  
• результаты испытаний с указанием единиц измерений;
  
  
• дату отбора пробы и способ отбора (если он известен);
  
  
• дату окончания проведения испытаний;
  
  
• информацию о выполнении требований к повторяемости результатов;
  
  
• все детали проведения испытаний, не оговоренные в настоящем стандарте или не считающиеся обязательными, а также все инциденты, наблюдавшиеся при проведении испытаний, которые могли повлиять на конечный результат.

Библиография