В данном разделе описана процедура, которая используется в испытании "Идентификация в Американской фармакопее (USP)", и которая основана на методе высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). Процедура используется для идентификации средств растительного происхождения (лекарственных веществ или лекарственных препаратов, ингредиентов или диетических добавок) в Компендиумах USP.
Для метода ВЭТСХ кратко описан необходимый контроль переменных со ссылками на более детальную информацию, приведенную в руководстве к использованию оборудования. Воспроизводимость результатов позволяет сравнивать очень близкие растительные компоненты, которые не являются активными ингредиентами. В аналитическом методе используют пластинки для ВЭТСХ; подходящее оборудование, позволяющее контролировать переменные; проводят испытание на пригодность системы, необходимое для эксплуатационной квалификации.
*[Примечание – Для дополнительной информации смотри – Идентификация средств растительного происхождения по процедуре высокоэффективной тонкослойной хроматографии<1064>].
Оборудование
Оборудование, необходимое для проведения метода ВЭТСХ, обычно включает:
- Пластинки: если не указано иначе в частной статье, следует использовать пластинки, покрытые однородным слоем, 200 мкм, пористого силикагеля (размер пор 60 Å) с неоднородным размером частиц 2-10 мкм (средний размер частиц 5 мкм), полимерным связующим веществом и флуоресцентным индикатором (F254) размером 20×10 см. [Примечание – преимущество отдается использованию ВЭТСХ пластинок на стеклянной подложке по сравнению с пластинками на алюминиевой подложке, что обусловлено лучшей механической стабильностью стеклянных пластинок].
- Прибор для нанесения указанных объемов проб в виде полос заданной длины на установленное место нанесения
- Подходящую хроматографическую камеру (например, камеру с перегородкой в центре дна), позволяющую контролировать насыщение и расстояние для элюирования
- Прибор, позволяющий контролировать активность стационарной фазы посредством контроля относительной влажности;
- Прибор для высушивания пластинок после элюирования, обеспечивающий получение воспроизводимых результатов
- Прибор для обработки пластинок обнаруживающим реагентом, если это необходимо
- Прибор для нагревания пластинок в процессе обнаружения, если это необходимо
- Cистема для документирования хроматограмм при длине волны УФ-254 нм, УФ-366 нм, и при дневном свете.
Каждый из этих приборов, как и система в целом, должны пройти инсталляционную квалификацию (IQ), операционную квалификацию (OQ), эксплуатационную квалификацию (PQ), чтобы гарантировать, что оборудование работает согласно его спецификациям, чтобы контролировать переменные в допустимых пределах. [Примечание – Для дополнительной информации смотри Квалификация аналитического оборудования <1058>]. Инсталляционную и операционную квалификации обычно проводит производитель оборудования. Испытания на пригодность системы, как подтверждение эксплуатационной квалификации, проводит аналитик.
Процедура
1. Приготовление испытуемого раствора
Если не указано иначе в частной статье, взвешивают 100 мг измельченного растительного ингредиента, или 10 мг сухого экстракта или фракции, или количество лекарственной формы, содержащее эквивалентное количество растительного ингредиента, добавляют 1 мл метанола, помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. После центрифугирования используют фильтрат или надосадочную жидкость как модельный раствор. Если не указано иначе в частной статье, 50 мкл
эфирного масла растворяют в 1 мл толуола и используют как модельный раствор.
2. Приготовление растворов стандартных образцов
Если не указано иначе в частной статье, USP стандартные образцы индивидуальных маркерных веществ растворяют в метаноле до получения концентрации 1 мг/мл. USP стандартные образцы экстрактов растворяют в метаноле путем встряхивания или при воздействии ультразвука до получения концентрации 10 мг/мл. Для эфирного масла, USP стандартные материалы растворяют в толуоле до получения концентрации 50 мкл/мл.
3. Нанесение проб и их размещение на пластинке
Растворы анализируемых веществ наносят в виде тонких полос длиной 8.0 ± 0.5 мм на расстоянии 8.0 ± 0.5 мм от нижнего края пластинки. Стандарты на пригодность системы наносят на стартовую линию на первую полосу на расстоянии не меньше чем 20 мм от края пластинки. Расстояние между полосами (от центра до центра) должно быть не менее 11.0 ± 0.5 мм. Необходимые объемы для нанесения указывают в частной статье (обычно от 2.0 до 10.0 мкл). Расстояние от линии старта до линии фронта растворителя отмечают карандашом возле правого или левого края пластинки, или может быть использован электронный детектор фронта растворителя.
4. Прекондиционирование пластинки
После нанесения анализируемого образца и если не указано иначе в частной статье, пластинку кондиционируют при относительной влажности 33% не менее 10 мин (например, пластинку помещают в закрытую камеру, содержащую насыщенный раствор магния хлорида).
5. Подготовка хроматографической камеры и элюирование пластинки
При использовании камеры с перегородкой в центре дна, заднюю стенку желоба выстилают фильтровальной бумагой. Камеру наполняют достаточным количеством раствора для элюирования для того, чтобы полностью импрегнировать фильтровальную бумагу, и достигнуть уровня жидкости в обоих желобах равного 5 мм. Закрывают крышку камеры и оставляют для насыщения на 20 мин.
Пластинку помещают вертикально в передний желоб камеры таким образом, чтобы слой с нанесенными образцами был повернут к фильтровальной бумаге. После прохождения подвижной фазы расстояния от линии старта до линии фронта элюента равного 6 см, пластинку вынимают из камеры и сушат в вертикальном положении в потоке холодного воздуха, что не влияет на целостность разделенных зон. Другие конфигурации камер и расстояния для элюирования могут быть
указаны в частной статье.
*[Примечание – могут быть использованы другие хроматографические камеры, если полученные результаты отвечают всем критериям на пригодность системы].
6. Процедура обнаружения
При использовании обнаруживающего реагента, однородно опрыскивают пластинку указанным количеством раствора реагента (обычно 1-2 мл), или погружают пластинку в раствор реагента при заданной скорости погружения и на определенное время. [Примечание – Для большинства неводных реагентов оптимальная скорость погружения – 50 мм/с, длительность удержания – 1 с].
7. Пригодность системы
Для проверки пригодности системы относительно разделения, положения и окраски зон, если не указано иначе в частной статье, выбирают два или более стандартных вещества, которые имеют близкие значения RF, но способны разделяться при заданных условиях хроматографирования; например, кислота хлорогеновая (голубое окрашвание) и гиперозид (желто-оранжевое окрашивание) в хроматографических системах на флавоноиды. Для пригодности системы могут быть использованы смеси станадартных образцов USP; или для контроля пригодности системы относительно разделения, положения и окраски зон могут быть использованы вещества, содержащиеся в стандартных образцах экстрактов USP. Описание разделения, положения, окраски главных зон «отпечатков» стандартных материалов должно соответствовать описанию, указанному в частной статье, в допустимых пределах. Требования пригодности системы, приведенные в частной статье, считаются выполненными, если полученные результаты соответствуют указанным требованиям.
8. Оценка и критерии приемлемости
Хроматограммы модельного раствора и раствора стандартного образца сравнивают в соответствии с описанием критериев приемлемости, приведенных в частной статье, по отношению к положению, разделению, окраске зон, и их интенсивности.
9. Документирование
В соответствии с современными требованиями надлежащей производственной практики, документирование результатов осуществляют в формате необходимом для их аудита. Для документирования должны быть использованы соответствующие приборы; например, камера, которая делает цифровые снимки в УФ- и при дневном свете; программное обеспечение для работы с графическими материалами, которое дает возможность архивировать, повторно использовать и анализировать полученные результаты, что облегчает электронное документирование.
Добавить комментарий